“魔剪CRISPR”再迎发文高峰！近期10篇Nature、Science、Cell……
基因编辑是近几年来生命科学领域的热门研究方向之一，经典的CRISPR/Cas9系统不仅已经应用到研究领域的多个方向，也有一批基于该技术的商业化公司应运而生。笔者上周曾在《》一文中总结了该技术近期的一些专利分布以及在疾病治疗中的应用现状。
正如Science文章中所提到的，CRISPR技术真正应用到治愈疾病中还有很长的路要走，还有很多障碍和限制性需要克服。目前，全球各国的科学家们也正积极地致力于对CRISPR系统的改进和发现研究。此前，除了CRISPR/Cas9，另一种大家较为熟悉的系统是张锋去年发表的CRISPR/ Cpf1，而最近中国科学家为基因编辑家族带来了新的成员。
5月2日，发表在Nature Biotechnology上的一项研究中，一个中国科学家小组报告了一种DNA导向的可用于人类细胞基因编辑的核酸内切酶——NgAgo。领导这一研究的河北科技大学副教授韩春雨表示，使用DNA而不是RNA作为引导工具取得一些优势，比如编辑对象所受限制更小、编辑精准度更高等。
据悉，NgAgo结合24个碱基的gDNA，这比Cas9的gRNA（19个碱基）要长5个碱基，理论上其精确性要提高1024（4的5次方）倍。此外，NgAgo–gDNA系统对向导序列-靶序列错配容忍度很低。gDNA上任何一个碱基的变换都会降低NgAgo的切割效率，如有三个错配则使其完全失活，这在另外一个机制上提高了NgAgo使用的精确性。
笔者注意到，除上述突破成果外，近阶段，Nature、Science、Cell三大顶级期刊上发布了多项与CRISPR技术相关的最新进展，其中包括了对系统结构的解析、新功能的开发以及对新系统的探索。以下汇总发表在三大主刊上的10篇重要进展：
Cell：突破性CRISPR新技术（5月12日）
High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing []
5月12日，发表在cell上的这项研究中，马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所的Ryohei Yasuda博士和他的研究小组开发出了一种他们命名为SLENDR（通过CRISPR/Cas9介导的同源指导修复单细胞标记内源性蛋白）的方法，可利用它来精确改造活体样品中的神经元DNA。
在实验模型中，该研究小组利用了子宫内电穿孔技术——使得他们能够将CRISPR/Cas9系统插入到仍然在发育及分裂的胎儿期脑细胞中。因此，断裂DNA仍然是通过HDR进行修复，这允许了研究人员添加进一个使得目的蛋白在显微镜下可见的基因。他们甚至可以在同一细胞中同时用不同的颜色可靠地标记两种不同的蛋白。研究人员利用各种成像方法以及DNA测序证实了SLENDR方法可以真实、精确地敲入基因。
Science：CRISPR技术新应用，快速鉴别基因变异（5月5日）
CRISPR-directed mitotic recombination enables genetic mapping without crosses []
5月5日，发表在Science上的这项研究中，由加州大学洛杉矶分校的Leonid Kruglyak领导的一个研究小组开发出了一项新技术，利用基因编辑系统CRISPR来快速鉴别基因变异。研究人员指出，数十年来尽管绘图研究已揭示出许多性状的基因位点，但鉴别潜在基因和变异却一直滞后。他们开发出了一种新型的CRISPR辅助的绘图方法，有望消除这一缺口。
Nature：科学家利用CRISPR-Cas9技术成功构建出细胞疾病模型（4月27日）
Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9 []
4月27日，在线发表于Nature上的这项研究中，来自洛克菲勒大学（Rockefeller University）和纽约干细胞研究所等机构的研究人员利用基于CRISPR的基因编辑技术成功在细胞中重现了疾病发生的过程。
研究描述了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑框架，它使得能够以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变。研究人员证实，通过整合一些阻断CRISPR/Cas沉默突变及致病突变可以显著提高HDR的精度，并建立了一种叫做“CORRECT”的方法来实现无痕基因组编辑。
利用这种方法，他们构建出了具有杂合子和纯合子显性早发阿尔茨海默病致病APPSwe和presenilin 1（PSEN1M146V）突变的人类诱导多能干细胞及衍生的大脑皮层神经元，这些细胞显示出基因型依赖性的疾病相关表型。
Nature：CRISPR再现“魔剪”实力，这次只“剪”单个碱基（4月20日）
Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage []
4月20日，在线发表于Nature上的这项研究中，科学家们报告称，一种经改造的CRISPR基因编辑系统能够赋予研究者们有效改变给定基因中单个DNA碱基的能力。这一研究进展进一步开拓了基因编辑的应用范围，且有望为开发多种疾病的治疗方法带来新的可能。
在这一研究中，科学家们找到一种不用切割就能编辑基因组的方法。他们改造了Cas9酶，使它不再能够切割DNA；然后将其与另一种能够将一种碱基（胞嘧啶，C）转变为另一种碱基（尿嘧啶，U）的酶绑定在一起。U通常存在于RNA中，在DNA中细胞会把它当作T来阅读。在这样一个系统中，导向RNA将经改造的Cas9送到基因组中的目标位置，系统中的另一种酶（碱基修饰酶APOBEC1）发挥改变DNA序列的作用，而不是去切断它们。
结果发现，经改造的这一系统在试管中对单独DNA的作用约达44%的时间，这是一个很大的提高；但在细胞中，最好的效率也只有7.7%。一个问题是，这一系统只是改变了其中一条DNA链，会使其与另一条链不匹配。此时，细胞会开始修复这种“错误匹配”，抵消酶系统的作用。
随后，Liu的团队开始添加另一种蛋白到经改造的Cas9上，用于阻止细胞从DNA上去除U。最终产生的这一碱基编辑器（base editor）纠正了小鼠细胞中阿尔茨海默病相关的突变，有效率高达75%。同时，这一碱基编辑器还纠正了人类细胞中癌症相关基因的突变，效率高达7.6%。此前，标准的CRISPR-Cas9方法从未做到这样。
【3篇文章】“组团”解析CRISPR/Cpf1系统
Cell：张锋新成果解析CRISPR/Cpf1系统（4月21日）
Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA []
4月21日，发表在Cell杂志上这项研究中，来自Broad研究所和东京大学的研究人员揭示出了Cpf1/向导RNA/靶DNA复合物的晶体结构。张锋及东京大学的Osamu Nureki教授是这一研究的共同通讯作者。
该研究中，科学家们确定了氨基酸球菌属（Acidaminococcus sp）Cpf1（AsCpf1）与向导RNA和靶DNA复合物的晶体结构，分辨率达到2.8 埃（Å）。AsCpf1采用了一种二裂片（bilobed）结构，RNA-DNA异源双链核酸分子束缚在中间通道内。他们通过比较AsCpf1和Cas9的结构，揭示出一些惊人的相似性和主要的差异，由此解释了它们独特的功能。
Nature：Emmanuelle Charpentier解析CRISPR/Cpf1系统（4月20日）
The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA [文献]
4月20日，在线发表于Nature上的这项研究中，CRISPR“两大女神”之一的Emmanuelle Charpentier领导的科学家小组证明了Cpf1在定向基因编辑中能执行RNA加工和DNA切割两个活动，这可能打开了对特定序列基因组编辑和沉默的新方向。
黄志伟教授和课题组成员在实验室（图片来源：哈尔滨工业大学官网）
Nature：中国科学家破译CRISPR/Cpf1运行机制（4月20日）
The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA []
4月20日，在线发表于Nature上的这项研究中，哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授及其团队首次揭示了CRISPR-Cpf1识别crRNA的复合物结构。
研究通过结构生物学和生化研究手段揭示了CRISPR-Cpf1识别CRISPR RNA以及Cpf1剪切pre-crRNA成熟的分子机制，这对认识细菌如何通过CRISPR系统抵抗病毒入侵的分子机理具有十分重要的科学意义。研究还发现，Cpf1并不是此前人们推测的二聚体状态，它本身是一个呈三角形的单体，位于该结构中间是一个带有正电荷的凹槽。这些研究为成功改造Cpf1系统，使之成为特异的、高效的全新基因编辑系统提供了结构基础。
Cell：首次利用CRISPR/Cas9靶向活细胞中的RNA（3月17日）
Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9 []
3月17日，发表于Cell上的这项研究中，来自美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员发现，CRISPR/Cas9有可能最终可用于研究广泛的疾病相关RNA过程，及操控基因转录进行疾病建模。论文通信作者Gene Yeo博士说：“据我们所知，这项研究是首次利用CRISPR-Cas9靶向作用于活细胞中的RNA。“
CRISPR-Cas9技术的特异性依赖于单向导RNA(sgRNA)，sgRNA与Cas9酶形成的一种复合物可在靶DNA序列中生成突变。在这项新研究中，研究人员从几个方面改造了CRISPR-Cas9系统，优化它用于RNA追踪。研究人员证实，他们的方法可用于追踪人类细胞中响应细胞应激的RNA活动。
Nature颠覆发现：病毒也有CRISPR样系统（2月29日）
MIMIVIRE is a defence system in mimivirus that confers resistance to virophage []
2月29日，在线发表于Nature上的这项研究中，法国科学家们报告称，巨型病毒mimiviruses拥有类似细菌CRISPR系统一样的抵御入侵的防御系统。
科学家们分析了60种mimivirus病毒株的基因组，结果发现，能够抵御Zamilon感染的Mimiviruses拥有与之向匹配的DNA短链。此外，在这些序列附近，研究人员发现了一些基因，它们能够编码降解DNA的酶。在CRISPR系统中，编码Cas酶的基因也在识别病毒的序列附近。研究还发现，阻断这一CRISPR样系统中的不同组件，会使得mimiviruses更易受到Zamilon的攻击。研究者们将这一类似CRISPR的系统命名为MIMIVIRE。
Science: 诺奖得主发现新型CRISPR系统（2月26日）
Direct CRISPR spacer acquisition from RNAby a natural reverse transcriptase–Cas1 fusion protein[文献]
2月26日，发表于Science上的这项研究中，科学家们发现，细菌具有一个可以识别及破坏危险病毒的系统，其利用了涉及核糖核酸（RNA）的一种新机制。它与捕获外源DNA的CRISPR/Cas系统非常相似。
斯坦福大学病理学与遗传学教授Andrew Fire，与德克萨斯大学奥斯汀分校细胞与分子生物学研究所所长lan Lambowitz是这篇论文的共同通讯作者。Andrew Fire因发现RNA干扰而共享了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。
研究小组第一次发现了细菌可以从病毒入侵者那里夺得一些RNA片段，并将这些RNA整合到自身的基因组中，在未来它们会帮助细菌识别及破坏危险的病毒。
特别备注：本文部分内容参考自生物通、生物谷。
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